熒光定量PCR儀校準方法與結果情況

實時熒光定量PCR儀特異性更強，自動化程度更高，且有效地解決了PCR污染的問題，應用領域及應用量都不斷增加。但其設計更為復雜，溫度模塊和光學系統(tǒng)設計同時影響其性能和實驗準確性，為定量PCR儀校準帶來了巨大挑戰(zhàn)。采用生物試劑等方式對定量PCR儀熒光部分校準缺乏溯源性，無法分析誤差來源，存在較大缺陷。

PCR儀操作簡單、靈敏度高，被廣泛地應用于分子生物學中。但傳統(tǒng)PCR儀不能準確定量，操作過程中易污染使得假陽性率高等缺陷。熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。這一技術特異性更強，自動化程度更高，且有效地解決了PCR污染。

因此，實時熒光定量PCR儀逐步取代普通PCR儀在臨床檢驗、檢驗檢疫、法醫(yī)鑒定、疾病控制、體外診斷試劑制造和研發(fā)、生物技術產(chǎn)品研發(fā)等領域得到了更為廣泛的應用。熒光定量PCR儀在普通PCR儀的技術上增加了熒光激發(fā)裝置和檢測系統(tǒng)，包含激發(fā)光光源、濾光片、鏡頭和熒光檢測器等。檢測系統(tǒng)有超低溫ＣＣＤ成像系統(tǒng)和光電倍增管ＰＭＴ。

熒光定量PCR儀光學校準方法與結果分析的性能起到?jīng)Q定性控制作用，共同決定最終實驗結果的準確性和可靠性。因此，對定量PCR儀的校準需求也逐步從單純的溫場校準轉向溫度加熒光的復合參數(shù)校準。

１，熒光定量PCR儀校準現(xiàn)狀

相對于傳統(tǒng)PCR儀，熒光定量PCR儀的影響因素更為復雜，主要因素包含化學試劑、溫度模塊的溫度因數(shù)、頂蓋溫度因數(shù)、鏡頭、反光鏡和光路通道、熒光接收器的敏感度、機械組成部分、熒光信號處理軟件的閾值設定，如基線，基線設定，Ｓ／Ｎ比例探測等，這就為熒光定量PCR儀的校準帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

國內校準機構目前針對熒光定量PCR儀的校準主要分為兩種情況：

一種是僅對熒光定量PCR儀的溫場部分進行校準，這種方法無法對熒光定量PCR儀光學部分進行校準，所獲得的結果不能對熒光定量PCR儀的性能進行全面評估；

另外一種方法是利用化學試劑對熒光定量PCR儀的進行熒光檢測，這種方法同樣存在極大缺陷。首先采用化學方法對定量PCR儀熒光系統(tǒng)進行校準，無法溯源到任何*的標準，不具備溯源性。其次，梯度稀釋試劑的過程中由于人為操作會引入一定的誤差，誤差值可能較大，直接影響到最終的檢測結果。最重要的是，采用這種方法進行校準，無法說明熒光定量PCR儀的溫度和熒光對最終定量結果的影響關系，誤差多少及誤差來源等。

隨著定量PCR儀的應用越來越廣泛，使用者迫切需要對熒光定量PCR儀的性能進行評估。在現(xiàn)有檢測手段無法滿足需求的情況下，熒光定量PCR儀使用者普遍采用兩種方式自行對儀器狀態(tài)進行判斷，一種是使用生物試劑測試盤這種檢測方法和采用已知濃度的質粒ＤＮＡ標準物質對樣本線性誤差進行校準的方法都屬于化學方法，這種方法僅能夠針對孔與孔間的組合線性進行測量，所得結果僅能代表PCR儀孔與孔間的平均結果，不能代表單孔的線性，無法真實反映儀器的性能。另一種方法是采用多臺不同廠家或型號定量PCR儀實驗比對的方式來比較不同儀器間的系統(tǒng)誤差，判斷系統(tǒng)誤差是否在臨床接受范圍內。這種方法既不具備溯源性，又需要對單個項目進行實驗比對，成本較高。

影響定量PCR儀結果重復性的２個主要原因是邊緣效應和實驗誤差，而邊緣效應是由于光路設計缺陷和控溫模塊缺陷導致的。如果光路設計存在缺陷，會導致PCR儀樣品槽的邊緣孔和中間孔光程存在差異，不同反映孔間熒光基團獲得的激發(fā)光能量存在差異，最終影響實驗結果。同時，加熱模塊的空間溫差同樣會導致這種邊緣效應，研究表明，孔間溫差的微小差別可能在基因擴增的過程中被指數(shù)級放大，最終影響實驗結果。此外，光路設計缺陷和孔間溫差的存在還會直接影響到熔解曲線的結果，使得不同儀器對熔解曲線的分辨率存在明顯差異。在通過熔解曲線檢測突變或進行單核苷酸多態(tài)性分析時，這種影響會導致無法成功區(qū)分突變基因或誤判突變基因。

因此，對定量PCR儀更加全面科學的校準方式是采用可溯源物理手段同時對熒光定量PCR儀的溫度部分和光學部分進行校準，并分析二者之間的聯(lián)系，以保障實驗結果的準確性。

２，定量PCR儀光學校準系統(tǒng)

基于上述定量PCR儀校準需求，本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR儀光學校準系統(tǒng)對定量PCR儀的溫場和熒光系統(tǒng)進行全面校準。系統(tǒng)在原有的PCR儀溫度校準系統(tǒng)基礎上運用可溯源光譜理論，將溫度和熒光檢測相結合，模擬定量PCR儀試驗，不僅可以對溫度模塊、上蓋溫度進行檢測，還能同時對熒光系統(tǒng)進行檢測，并分析而二者的相關性，更準確地確定定量PCR儀誤差及誤差來源。

前端傳感器示意圖檢測系統(tǒng)鑲嵌經(jīng)校準并可用光譜儀溯源的發(fā)光LEG，通過給定電流量的不同會產(chǎn)生不同區(qū)強度的熒光模擬標準熒光激發(fā)，并通過對熒光激發(fā)部分的溫度控制。

這種設計避免了光譜的漂移，保證LEG的激發(fā)光在運行過程中保持絕對的同一水平，這種采用物理手段進行檢測，避免了人為操作引入的誤差，更加準確。這種熒光檢測方法通過了國際認證，運用了可溯源光譜理論，可溯源溫度計量來對熒光定量PCR進行*的檢測，系統(tǒng)根據(jù)溯源性、可靠性和準確性。

系統(tǒng)溫度部分可以對定量PCR儀的溫度準確度、孔間溫差、實時升溫速率、實時降溫速率、溫度過沖、溫度持續(xù)時間、上蓋溫度進行校準。熒光部分可以對定量PCR儀的Ｃｑ（Ｃｔ）相差值、精確度、熒光飽和值、熒光線性、熔解曲線精確度及一致性，熔解溫度的比例關系及線性靈敏度等進行檢測。

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